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O vírus Nipah (NiV) é um paramixovírus zoonótico altamente letal que causa encefalite fatal em humanos, com morcegos frugívoros do gênero Pteropus servindo como seu reservatório natural. Surto ocorreram na Malásia, Singapura, Bangladesh e Índia, com o primeiro surto no sul da península indiana em Kerala em 2018, relatando 18 casos confirmados em laboratório. Devido à sua alta taxa de fatalidade e à falta de tratamentos eficazes, estudos sobre NiV infeccioso são restritos a instalações BSL-4. Para facilitar a pesquisa e a vigilância, sistemas substitutos, como partículas semelhantes a vírus (VLPs) e pseudovírus, são empregados, permitindo estudos em instalações BSL-2. Esses sistemas utilizam glicoproteínas estruturais F e G do NiV, que são cruciais para a ligação e entrada do vírus.
morcegos do gênero Pteropus usados em estudos sobre o vírus Nipah
Um desafio significativo na geração desses sistemas substitutos é garantir a uniformidade lote a lote, principalmente devido às dificuldades em alcançar a incorporação proporcional e consistente das proteínas F e G nas células produtoras e nas partículas resultantes. Para resolver isso, os pesquisadores estabeleceram células produtoras de pseudovírus HEK293 que co-incorporam de forma estável as proteínas F e G do NiV. Através da análise de triagem celular ativada por fluorescência (FACS) e seleção clonal, células com níveis de co-incorporação altos e uniformes foram identificadas e expandidas. Este sistema refinado gera de forma reprodutível pseudovírus baseados no vírus da estomatite vesicular (VSV) de alto título que exibem incorporação consistente de ambas as glicoproteínas.
Os pseudovírus Nipah (NiV) gerados foram testados em ensaios funcionais e demonstraram neutralização dose-dependente por anticorpos anti-NiV F e G comerciais, bem como por soro de convalescentes de pacientes recuperados de Nipah. Um teste de neutralização de pseudovírus (PVNT) foi estabelecido usando fosfatase alcalina secretada (SEAP) como repórter, oferecendo um tempo de resposta rápido e adaptabilidade para automação de alto rendimento. Espera-se que este ensaio seja valioso para estudos de sorovigilância humana e animal em larga escala em regiões endêmicas de Nipah, bem como para rastrear potenciais inibidores de entrada de vírus e anticorpos monoclonais.
O estudo detalha a geração de vetores de expressão de NiV F e G usando sequências da cepa do surto de Kerala de 2018. Células HEK293 foram co-transfectadas com esses plasmídeos e selecionadas usando higromicina e geneticina para criar células policlonais transfectadas de forma estável. Uma seleção clonal adicional foi realizada por meio de diluição limitante, resultando em três clones de bom crescimento (293 FG-5F6, 293 FG-7C5 e 293 FG-8C7) caracterizados para expressão de proteína F e G usando citometria de fluxo e imunofluorescência. Os pseudovírus foram produzidos usando um sistema baseado em VSV (rVSV G*∆G-SEAP) e caracterizados quanto ao seu título usando um ensaio de unidade formadora de manchas e medição da atividade de SEAP em células BHK-21 alvo.
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