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Resumo
A depressão maior (DM) é uma condição psiquiátrica complexa com impacto individual e social significativo e marcada variabilidade na resposta ao tratamento. Identificar biomarcadores que prevejam a eficácia de antidepressivos continua sendo um grande desafio, e as abordagens metabolômicas oferecem uma ferramenta poderosa para desvendar alterações bioquímicas associadas à depressão e ao resultado do tratamento. O córtex pré-frontal e o hipocampo são regiões cerebrais chave envolvidas na fisiopatologia da DM e na resposta a antidepressivos. A fluoxetina, um dos antidepressivos mais comumente prescritos, influencia não apenas a sinalização serotoninérgica, mas também o sistema endocanabinoide. Consequentemente, a avaliação dos níveis de endocanabinoides pode fornecer informações cruciais sobre sua contribuição e o efeito da fluoxetina.
Para identificar biomarcadores associados à resposta antidepressiva precoce, camundongos machos foram expostos por 5 semanas ao protocolo de estresse crônico imprevisível leve (ECIL), com tratamento com fluoxetina administrado durante a última semana. Análises por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem de amostras do hipocampo e do córtex pré-frontal revelaram que a melhora comportamental após tratamento de curto prazo com fluoxetina foi acompanhada por um aumento nos níveis de 2-araquidonoilglicerol (2-AG) no hipocampo, juntamente com a redução dos níveis de GABA e glutamato no córtex pré-frontal. Esses achados sugerem que o aumento dos níveis de 2-AG pode predizer uma resposta precoce à fluoxetina.
Introdução
Os transtornos depressivos incluem um grupo de doenças caracterizadas pela presença de humor triste, vazio e/ou irritável, associado a alterações que afetam significativamente a capacidade de funcionamento do indivíduo [1]. Devido à sua duração e aos efeitos na atividade diária, o Transtorno Depressivo Maior (TDM) é o problema de saúde mental mais incapacitante [2]. Quase metade dos pacientes não responde à medicação antidepressiva [3, 4], o que está associado ao aumento da utilização e dos custos dos serviços de saúde [5]. Os tratamentos que evitam a recaída e alcançam a remissão completa continuam sendo um grande desafio.
Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRS), incluindo a fluoxetina, são considerados uma opção de primeira linha [6]. A fluoxetina apresenta alta adesão [7, 8] e efeitos benéficos não específicos sobre a noradrenalina e a dopamina [9], a inflamação [10] e o sistema endocanabinóide [11, 12]. No entanto, apresenta alta variabilidade de resposta [7], o que representa um obstáculo na prática clínica, visto que cada etapa adicional de tratamento diminui a probabilidade de remissão e sucesso da resposta [13].
O modelo de depressão mais amplamente utilizado em roedores, o estresse crônico imprevisível leve (CUMS), está associado a alterações comportamentais relacionadas à anedonia [14,15,16], desespero [16,17,18,19], ansiedade [19,20,21] e deterioração física [18, 22]. Além disso, evidências anteriores indicam que o CUMS induz alterações profundas no panorama metabolômico, particularmente no sistema endocanabinoide e nas vias de neurotransmissores que regulam o humor, a recompensa e a adaptação ao estresse [16, 19, 20, 23,24,25]. Com base nessas disrupções neuroquímicas, a administração crônica de fluoxetina demonstrou neutralizar os déficits comportamentais induzidos pelo CUMS, restabelecendo o equilíbrio dos neurotransmissores [16, 17, 26].
No entanto, os efeitos da fluoxetina parecem ser específicos do sistema endocanabinóide e da região, como sugerido pelo aumento da AEA na amígdala para facilitar a extinção do medo [26], mas pela ausência de alterações no 2-AG e na AEA no córtex pré-frontal, no hipocampo e no hipotálamo [11]. Além desses efeitos neuroquímicos, a fenotipagem comportamental recente revelou uma variabilidade interindividual significativa, com a diferenciação de duas populações divergentes de camundongos: respondedores, que exibem restauração do fenótipo comportamental, e não respondedores [27, 28]. Essa estratificação comportamental sugere que a eficácia clínica da fluoxetina pode depender de marcadores metabólicos, destacando a necessidade de uma caracterização mais profunda dos efeitos da fluoxetina.
Técnicas metabolômicas avançadas, como a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS), ajudam a desvendar alterações bioquímicas complexas associadas ao transtorno e aos resultados do tratamento [20, 29].
O presente estudo investigou os efeitos da administração de fluoxetina em curto prazo sobre os níveis de endocanabinoides e os perfis de neurotransmissores no córtex pré-frontal e no hipocampo. Utilizando LC-MS/MS, buscamos elucidar as alterações metabólicas precoces associadas à melhora comportamental, identificando, assim, potenciais biomarcadores de resposta inicial à fluoxetina no modelo animal de estresse crônico imprevisível (CUMS).
Materiais e métodos
Animais e ética
Camundongos machos C57BL/6J (8 semanas de idade) (n = 60) foram adquiridos (Charles River, França). Com exceção do grupo controle (n = 8) (CONTROLE-VEÍCULO), que foi agrupado em 4, os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas de acrílico e mantidos em um ambiente com temperatura (21 ± 1 °C) e umidade (55 ± 10 por cento) controladas. Água e ração foram disponibilizadas ad libitum. Todos os experimentos comportamentais foram realizados durante a fase clara de um ciclo de 12 horas (luzes acesas às 7h30 e apagadas às 19h30).
Os procedimentos e cuidados com os animais foram conduzidos de acordo com a Diretiva das Comunidades Europeias 2010/63 / UE e o Real Decreto Espanhol 53/201RD, seguindo as diretrizes "Animals in Research: Reporting Experiments" (ARRIVE), e aprovados pelo local (Comitè Ètic d'Experimentació Animal-Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona, CEEA-PRBB) e autônomo (Generalitat de Catalunya, Departament de Territori i Sostenibilitat) comitê de ética. Todos os experimentos comportamentais e bioquímicos foram realizados por um pesquisador cego às condições experimentais.
Administração de medicamentos
O cloridrato de fluoxetina (0927, Tocris) dissolvido em solução salina (0,9 por cento NaCl) ou veículo (0,9 por cento NaCl) foi injetado intraperitonealmente (i.p.) na dose de 10 mg/kg diariamente, das 14h às 16h, durante 7 dias consecutivos.
Protocolo de estresse crônico leve imprevisível
Após a chegada, os animais foram alocados aleatoriamente nos grupos Controle ou CUMS, de acordo com a ordem do número de registro fornecido pelo biotério. O peso corporal foi medido para garantir que não houvesse diferenças entre os grupos. Antes do tratamento com fluoxetina, e dentro dos grupos CUMS, os dez animais com o primeiro número de registro fornecido pelo biotério receberam o veículo. Os demais receberam o tratamento com fluoxetina. Novamente, o peso corporal foi medido para garantir que não houvesse diferenças de peso antes do início do tratamento com fluoxetina.
Após uma semana de aclimatação, os camundongos foram submetidos a 5 semanas de estresse crônico imprevisível (CUMS), conforme descrito anteriormente [27]. Os estressores foram aplicados duas vezes ao dia, durante um período de 3 horas, e durante a noite, em ordem aleatória. Os estressores diurnos incluíram: cama molhada, gaiolas inclinadas a 45°, alojamento em pares ou em superlotação, privação de água e confinamento em um espaço reduzido com superfície quadriculada, acesso restrito à comida e troca de gaiolas. Os estressores noturnos incluíram: luzes piscantes, inversão do ciclo claro-escuro, gaiolas inclinadas a 45° e cama molhada. Antes do início do protocolo e uma vez por semana após, o peso e a apatia (autolimpeza e estado da pelagem) dos animais foram avaliados.
Após 4 semanas, os animais submetidos ao protocolo CUMS foram aleatoriamente alocados aos grupos fluoxetina (CUMS-FLUOX, n = 40) ou veículo (CUMS-VEH, n = 10) (Fig. 1-(a)). Ao final do protocolo experimental e 24 horas após a última administração, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Após a decapitação, os cérebros foram removidos, colocados em gelo, e o córtex pré-frontal e o hipocampo foram dissecados, pesados, congelados em nitrogênio líquido e armazenados a −80 °C.
O tamanho da amostra (n = 58, n = 8 para controles, n = 10 para CUMS-veículo e n = 40 para CUMS-fluoxetina) foi selecionado com base em resultados anteriores do laboratório e na literatura anterior que trabalhou com o modelo CUMS e estudos comportamentais e metabolômicos usando camundongos C57Bl/6 [20]. O tamanho de amostra maior para o grupo CUMS-fluoxetina foi propositalmente atribuído para garantir poder estatístico suficiente após a estratificação dos subgrupos em respondedores e não respondedores.
Apatia
A pelagem e o tempo de higiene foram medidos como indicadores de apatia [30]. A pontuação do estado da pelagem do animal foi calculada como a soma das pontuações, uma para cada uma das 7 partes do corpo (cabeça, pescoço, dorsal, ventral, cauda, patas dianteiras e patas traseiras). Cada parte recebeu uma pontuação em uma escala de 3 pontos (1 = ruim, 2 = regular, 3 = muito bom) [27]. No teste de imersão, o material do ninho foi temporariamente removido e os animais foram atingidos por respingos de uma solução de glicerol a 20 por cento na superfície dorsal. O comportamento de higiene autodirigida foi registrado por 5 minutos, e a latência, o número total de eventos e o tempo gasto em autolimpeza foram medidos manualmente.
Desespero comportamental
O desespero comportamental foi medido com o teste de natação forçada (TNF) [31] após 4 semanas de estresse crônico imprevisível (ECI) e o teste de suspensão pela cauda (TSC) ao final do protocolo experimental. No TNF, os camundongos foram colocados em cilindros cheios de água (30 cm de altura e 15 cm de diâmetro) por 6 minutos. O tempo de imobilidade, considerado como o período em que os camundongos flutuavam em posição vertical e realizavam apenas pequenos movimentos para manter a cabeça acima da água, foi medido manualmente durante os últimos 4 minutos [32]. No TSC, os camundongos foram suspensos individualmente pela cauda com fita adesiva colocada a 1 cm da ponta da cauda, e a suspensão foi registrada durante uma sessão de 6 minutos. O tempo de imobilidade, considerado como a ausência completa de movimento, foi registrado a partir dos últimos 4 minutos [33].
Os animais que caíram ou se apoiaram na própria cauda foram descartados.
Quantificação de endocanabinoides cerebrais por LC-MS/MS
AEA e 2-AG foram quantificados conforme descrito anteriormente [34], com algumas modificações. Resumidamente, um hemisfério hipocampal (21,2 ± 6,43 mg) foi homogeneizado em 700 µL de Tris-HCl 50 mM (pH 7,4): metanol (1:1) contendo padrões internos deuterados (AEA-d4, DHEA-d4, 2-AG-d5 e 2-OG-d5; Cayman Chemical e Toronto Research Chemicals). Adicionou-se clorofórmio (5 mL), as amostras foram agitadas por 20 min e centrifugadas (1700 g, 5 min, temperatura ambiente). A fase orgânica foi evaporada sob nitrogênio, reconstituída em 100 µL de água: acetonitrila (10:90, v/v) com 0,1 por cento de ácido fórmico e transferida para microvials para análise por LC-MS/MS.
As análises foram realizadas utilizando um sistema Waters Acquity UPLC acoplado a um espectrômetro de massas Xevo TQ-S micro. A separação cromatográfica foi obtida em uma coluna BEH C18 (2,1 × 100 mm, 1,8 µm) a 40 °C, com uma vazão de 0,4 mL/min e uma fase móvel composta por ácido fórmico 0,01 por cento em água e acetonitrila. A detecção foi realizada no modo de monitoramento de múltiplas reações (MRM) e a quantificação foi feita por diluição isotópica.
Quantificação de metabólitos cerebrais por LC-MS/MS
O tecido hipocampal remanescente (21,06 ± 7,16 mg) e as amostras do córtex pré-frontal (26,35 ± 8,99 mg) foram homogeneizadas em acetonitrila: água (2:1, 0,1 por cento de ácido fórmico; 25 mg de tecido/600 µL). Após centrifugação (14.500 rpm, 5 min, 4 °C), os sobrenadantes foram coletados e processados utilizando dois procedimentos analíticos.
Para a determinação de GABA e glutamato (método A), alíquotas (10 µL) foram misturadas com padrões internos marcados (GABA-d6 e Glu-d5) e acetonitrila, homogeneizadas em vórtex, centrifugadas e transferidas para microvials. Para monoaminas, aminoácidos e metabólitos (método B), alíquotas maiores (300 µL) foram combinadas com uma mistura de padrões internos marcados, evaporadas sob nitrogênio e derivatizadas com cloreto de dansila em condições alcalinas antes da análise por LC-MS/MS.
As análises foram realizadas em um sistema UPLC Acquity I-Class acoplado a um espectrômetro de massas Xevo TQ-S micro equipado com uma fonte de ionização por eletrospray operando no modo positivo. Os parâmetros da fonte foram definidos da seguinte forma: tensão capilar de 3 kV, temperatura da fonte de 150 °C, temperatura de dessolvatação de 600 °C, fluxo de gás de dessolvatação de 1200 L/h e fluxo de gás de cone de 50 L/h. Nitrogênio foi utilizado como gás de nebulização e secagem, e argônio como gás de colisão. A aquisição e o processamento dos dados foram realizados utilizando o software MassLynx v4.1.
Para o método. A, a separação foi realizada em uma coluna BEH Amide utilizando um gradiente de acetonitrila/água contendo formiato de amônio e ácido fórmico. Para o método B, foi utilizada uma coluna BEH C18 e um gradiente de metanol/água. As transições MRM para cada analito estão apresentadas na Tabela 1. As curvas de calibração foram geradas em 12 níveis de concentração utilizando padrões externos e processadas com o software TargetLynx XS.
Análise estatística
Os resultados comportamentais e metabolômicos são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). A classificação de respondedores e não respondedores foi baseada nas variáveis de desfecho: tempo total de limpeza (teste de imersão), escore da pelagem, peso corporal e tempo de mobilidade (TST). Todas as variáveis foram codificadas de forma que um aumento em umérico representasse uma melhora comportamental. Para o TST, os valores ausentes foram imputados utilizando a média do grupo para manter a integridade da análise. Os dados comportamentais foram normalizados antes da análise de componentes principais (ACP). Após a ACP, os animais foram classificados em dois grupos utilizando o algoritmo k-means com dois centroides. Para garantir que a divisão não fosse arbitrária, a decisão sobre o número ideal de clusters foi determinada utilizando o método do cotovelo.
Os animais tratados com fluoxetina e submetidos ao estresse crônico imprevisível (CUMS) que se agruparam com os animais do grupo controle (CONTROLE-VEÍCULO) foram classificados como respondedores, pois exibiram um fenótipo comportamental indistinguível do de camundongos não submetidos a estresse. Por outro lado, os ratos submetidos a estresse crônico imprevisível (CUMS) e tratados com fluoxetina, que se segregaram no grupo composto principalmente por ratos tratados com veículo e submetidos a CUMS, foram classificados como não respondedores, indicando a ausência de efeito terapêutico.
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